تولید و پخش انواع کیت های آزمایشگاهی

نمی‌دانید

کیت‌های استخراج DNA چگونه کار می‌کنند؟ ما در این مقاله اصول اولیه را پوشش می‌دهیم تا بتوانید جداسازی اسید نوکلئیک خود را کامل کنید و DNA با کیفیت بالا دریافت کنید.

ما در Bitesize Bio به عیب‌یابی زیادی در زمینه

استخراج RNA و DNA کمک می‌کنیم زیرا تقریباً هر کاری که در زیست‌شناسی مولکولی انجام می‌دهیم در همان مرحله اول به DNA یا RNA نیاز دارد، چه qPCR، شبیه‌سازی مولکولی، توالی‌یابی نسل بعدی یا چیز دیگری.

این روزها، بیشتر آزمایشگاه‌ها از کیت‌های استخراج DNA تجاری استفاده می‌کنند که از روش فیلتر چرخشی سیلیس برای بدست آوردن DNA با کیفیت بالا استفاده می‌کنند. اینها به تصفیه سریع و کارآمد DNA (یا RNA) اجازه می دهند. اما این بدان معناست که بسیاری از مردم فقط دستورالعمل ها را دنبال می کنند و نمی دانند کیت های استخراج DNA چگونه کار می کنند.

چرا باید بدانید

کیت های استخراج اسید نوکلئیک چگونه کار می کنند؟

ستون های اسپین حاوی رزین سیلیکا هستند که بسته به شرایط نمک و سایر عوامل تحت تاثیر روش استخراج، DNA و RNA را به صورت انتخابی متصل می کند.

این کیت‌های استخراج DNA کل فرآیند را بسیار آسان‌تر و سریع‌تر از روش‌های جداسازی DNA قدیمی می‌کنند، زمانی که همه چیز خوب پیش می‌رود.

با این حال، نقطه ضعف استفاده از کیت این است که اگر متوجه نشدید در جعبه سیاه کیت چیست، عیب یابی بسیار دشوارتر می شود.

بنابراین در این مقاله، من با جزئیات توضیح خواهم داد که کیت های استخراج DNA چگونه کار می کنند و در هر مرحله چه اتفاقی می افتد.

همچنین برخی از مشکلات رایج مربوط به استفاده از ستون‌های سیلیکا در استخراج DNA را بررسی می‌کنم که فقط با کمی درک بیشتر می‌توان از آن‌ها غلبه کرد یا از آنها اجتناب کرد.

مرحله اول در استخراج RNA و DNA: لیز

فرمول های لیز ممکن است بر اساس اینکه آیا می خواهید DNA یا RNA استخراج کنید متفاوت باشد، اما مخرج مشترک یک بافر لیز حاوی غلظت بالایی از نمک آشوبگر است.

معرفی Chaotropes

آشوب‌گردها پیوندهای هیدروژنی، نیروهای واندروالس و برهمکنش‌های آبگریز را بی‌ثبات می‌کنند. پروتئین ها از جمله نوکلئازها بی ثبات می شوند و ارتباط اسیدهای نوکلئیک با آب مختل می شود و شرایط انتقال به سیلیس را فراهم می کند.

نمک های چائوتروپیک شامل گوانیدین HCL، گوانیدین تیوسیانات، اوره و لیتیوم پرکلرات است.

مواد شوینده را فراموش نکنید
علاوه بر آشفتگی ها، معمولاً برخی مواد شوینده در بافر لیز وجود دارد که به حل شدن و لیز پروتئین کمک می کند.

برخی از آنزیم ها را اضافه کنید
بسته به نوع نمونه ها می توان از آنزیم هایی نیز برای لیز استفاده کرد. پروتئیناز K یکی از این موارد است و در واقع در این بافرهای دناتوره کننده بسیار خوب عمل می کند. هر چه پروتئین دناتوره تر باشد، پروتئیناز K بهتر عمل می کند.

لیزوزیم، با این حال، در دناتوره کردن کار نمی کند و بنابراین درمان لیزوزیم معمولا قبل از افزودن نمک های دناتوره انجام می شود.

نکته ای در مورد آماده سازی پلاسمید
یک نظر در مورد جداسازی DNA پلاسمید: لیز بسیار متفاوت از استخراج برای RNA یا استخراج DNA ژنومی است زیرا ابتدا پلاسمید باید از DNA ژنومی جدا شود.

اگر هرج و مرج پرتاب کنید، همه چیز را به یکباره رها می کنید و نمی توانید DNA دایره ای کوچک را از کروموزوم با وزن مولکولی بالا جدا کنید.

بنابراین، در آماده سازی پلاسمید، چائوتروپ ها تا پس از لیز اضافه نمی شوند و نمک ها برای اتصال استفاده می شوند.

یک مقاله عمیق و عالی در مورد لیز قلیایی در اینجا و همچنین مقاله دیگری در مورد تفاوت بین DNA ژنومی و DNA پلاسمید برای مطالعه بیشتر در دسترس است.

پس از استخراج DNA، خالص سازی انجام می شود: اتصال DNA به ستون

نمک های آشوبگر برای لیز و همچنین برای اتصال DNA (یا RNA) به ستون حیاتی هستند. علاوه بر این، برای تقویت و تأثیرگذاری بر اتصال اسیدهای نوکلئیک به سیلیس، الکل نیز اضافه می شود.

بیشتر اوقات این اتانول است اما گاهی اوقات ممکن است ایزوپروپانول باشد. درصد اتانول و حجم آن اثرات بزرگی دارد. خیلی زیاد است و شما مقدار زیادی اسیدهای نوکلئیک تخریب شده و گونه های کوچک وارد می کنید که بر خوانش A260 تأثیر می گذارد و برخی از بازده شما را کاهش می دهد. خیلی کم است و ممکن است شستن تمام نمک از غشاء دشوار شود.

نکته مهم در اینجا این است که اتانول بر اتصال تأثیر می گذارد و مقدار اضافه شده برای هر کیتی که استفاده می کنید بهینه می شود. اصلاح این مرحله می‌تواند به تغییر آنچه بازیابی می‌کنید کمک کند، بنابراین اگر در بازیابی RNA یا DNA مشکل دارید و می‌خواهید آن را عیب‌یابی کنید، می‌تواند گامی برای ارزیابی بیشتر باشد.

راه دیگر برای تشخیص مشکلات این است که جریان را پس از اتصال ذخیره کنید و آن را رسوب دهید تا ببینید آیا می توانید اسیدهای نوکلئیک مورد نظر خود را پیدا کنید.

اگر از مواد شوینده حاوی SDS در لیز استفاده می کنید، سعی کنید از NaCl به عنوان رسوب دهنده استفاده کنید تا از آلودگی DNA یا RNA با مواد شوینده جلوگیری کنید.

شستشوی DNA (یا RNA)

لیز شما از طریق غشای سیلیکا سانتریفیوژ شد و اکنون DNA یا RNA استخراج شده شما باید به ستون متصل شود و ناخالصی ها، پروتئین های سلولی و پلی ساکاریدها باید از آن عبور کرده باشند.

اما، غشاء هنوز با پروتئین های سلولی و نمک باقیمانده کثیف است. اگر نمونه از گیاهان باشد، هنوز پلی ساکاریدها وجود خواهد داشت، شاید مقداری رنگدانه روی غشاء باقی بماند، یا اگر نمونه خونی بود، ممکن است غشاء قهوه ای یا زرد رنگ باشد.

مراحل شستشو برای از بین بردن این ناخالصی ها عمل می کند.

معمولاً دو شستشو وجود دارد، اگرچه بسته به نوع نمونه می تواند متفاوت باشد. اولین شستشو اغلب دارای مقدار کمی نمک آشوبگر برای حذف پروتئین و آلاینده های رنگی است. این همیشه با شستشوی اتانول برای حذف نمک ها دنبال می شود.

اگر آماده‌سازی چیزی است که پروتئین زیادی برای شروع ندارد، مانند آماده‌سازی پلاسمید یا پاک‌سازی PCR، تنها به شستشوی اتانول نیاز است.

حذف نمک های آشوبگر برای بدست آوردن بازده بالا و خلوص بالا DNA یا RNA بسیار مهم است. برخی از کیت ها حتی ستون را دو بار با اتانول شستشو می دهند.

اگر نمک باقی بماند، شستشوی اسید نوکلئیک ضعیف خواهد بود و قرائت A230 بالا خواهد بود و در نتیجه نسبت‌های 260/230 پایین خواهد بود.

استخراج RNA و DNA، مرز نهایی: شستشو

مرحله نهایی در پروتکل استخراج DNA، آزادسازی DNA یا RNA خالص از سیلیس است.

برای آماده سازی DNA معمولاً از 10 میلی مولار Tris در pH بین 8-9 استفاده می شود. DNA در pH کمی پایه پایدارتر است و سریعتر در بافر حل می شود. این حتی برای گلوله های DNA نیز صادق است. آب تمایل به داشتن pH پایین، به اندازه 4-5 دارد و DNA با وزن مولکولی بالا ممکن است در مدت زمان کوتاهی که برای شستشو استفاده می شود، به طور کامل آبرسانی نشود.

شستشوی DNA را می توان با اجازه دادن به بافر برای چند دقیقه قبل از سانتریفیوژ در غشاء به حداکثر رساند.

از طرف دیگر RNA در pH کمی اسیدی خوب است و بنابراین آب رقیق کننده ترجیحی است. RNA به راحتی در آب حل می شود.